李秋 个体化新抗原疫苗的临床研究进展

【发布日期】:2022-08-04【查看次数】:

  医学博士、主任医师、博士生导师。四川省学术和技术带头人、中国医师协会肝癌内科专业委员会主任委员、中国抗癌协会肿瘤支持治疗内科专业委员会副主任委员、中国临床肿瘤学会(CSCO)中西医结合专家委员会常务委员、中国生物医学工程学会肿瘤分子靶向治疗专委会常务委员、四川省抗癌协会抗癌药物专业委员会主任委员、成都市医学会药物经济学专业委员会主任委员。专注于消化道恶性肿瘤的生物靶向治疗、化疗和综合治疗。主持多项 863课题、973 子课题、国家自然科学基金、省部级科研项目。在 Int J Cancer等杂志发表论著 50余篇。

  免疫疗法的发展彻底改变了肿瘤治疗的格局。个体化新抗原疫苗是一种具有吸引力的全身性免疫疗法,可触发针对具有高度特异性新抗原的 T 细胞反应,诱导辅助性和细胞毒性 T 淋巴细胞的活化以增强抗肿瘤免疫。基于生物信息学的快速发展和测序技术的不断更新,新抗原疫苗得到了快速地发展,研究者们得以在不同的瘤种中进行新抗原疫苗单独或者联合治疗价值的探索。本文概述了制备个体新抗原疫苗的复杂过程,讨论了在肿瘤患者中进行个体化新抗原疫苗的临床研究的现状,对这种新颖的、个体化的免疫治疗方法的未来进行了展望。

  癌症免疫治疗被定义为通过免疫系统来识别和摧毁癌细胞。在过去的十年中,各种免疫疗法在治疗肿瘤方面取得了飞速发展,而在已被批准的免疫治疗药物中,治疗性癌症疫苗具有诱导针对肿瘤抗原特异性免疫反应的优势。癌症疫苗通常包括选定的肿瘤抗原、结合激活树突状细胞(dendriticcells,DCs)的佐剂,或者 DCs本身。治疗性癌症疫苗的目的是激活患者针对特定肿瘤抗原的适应性免疫系统,以控制肿瘤生长、诱导肿瘤消退并根除微小的残留病灶。但治疗性癌症疫苗的有效性受到多种因素的影响,包括靶抗原的选择、佐剂的使用以及癌症疫苗在高度免疫抑制的肿瘤微环境中诱导抗肿瘤 T细胞反应的能力 。其中抗原特异性治疗性疫苗的效力在很大程度上取决于疫苗中抗原的性质。

  尽管肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)具有在肿瘤中异常表达或过度表达的特点,但是由于 TAA特异性 T细胞受到中枢和(或)外周耐受的影响,其难以成功产生临床有效的抗肿瘤免疫反应。最近,人们的注意力转向了“新抗原”(neoantigen),它主要来源于肿瘤细胞突变而产生的独特的自身抗原表位。因此,新抗原是肿瘤特异性的,被适应性免疫系统识别为外来表位。肿瘤新抗原可以激活不受免疫耐受影响的高活性细胞毒性 T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL),并且可以防止对非恶性组织的“脱靶”损伤。此外,研究表明,这些疫苗诱导新抗原特异性 T 细胞反应增强且持续存在,并具有治疗后免疫记忆的潜力,因而具有免于或推迟疾病复发的长期保护的可能性[3]。近年来,已有越来越多的研究证实新抗原是各个疫苗平台的理想靶抗原。

  因此,我们在既往研究的基础上,对新抗原及新抗原疫苗的研究进展进行了阐述,总结了疫苗接种策略及相关临床研究。最后,我们讨论了个体化新抗原疫苗应用的障碍及可能有效的相关解决方案。

  肿瘤新抗原形成于肿瘤细胞中发生的突变,具有肿瘤细胞特有表达、且正常细胞不表达的特点。而在更广泛的定义上,还包括人类内源性逆转录病毒(human endogenous retroviruses,HERVs)通过 DNA去甲基化在肿瘤中表达、翻译后修饰[4-5]等。在此,本文仅涉及与突变相关的肿瘤新抗原。

  SNVs是肿瘤中最常见的基因组水平突变类型,由非同义突变编码的蛋白质产生的变异肽可能通过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)分子呈递到肿瘤细胞表面,形成肿瘤抗原[6]。大多数 SNVs通过单一氨基酸替代产生新的抗原。SNVs是临床试验中新抗原预测工作的重点。SNVs衍生的新抗原及抗原肽已成功在多个瘤种中筛选及制备,包括具有高突变负荷的黑色素瘤和肺癌,以及具有中低突变负荷的肝癌和胶质母细胞瘤[7-12]。最近的研究报道,在接受免疫检查点抑制剂(immune checkpoints inhibitor,ICIs)治疗的患者中,基于 SNVs的新抗原负荷与 ICIs临床获益相关[13-14]。但由于其与非突变的肽段本身相似,因此大部分 SNVs衍生的新抗原并没有免疫原性,需要进一步进行严格地筛选。而由于发生的随机性质,体细胞癌症突变是高度个体化的,由 SNVs产生的新抗原极少在不同患者之间共享,限制了基于共有肿瘤新抗原的有效通用癌症疫苗的开发。

  肿瘤新抗原另外一种重要的来源为 Indels。外显子区域 Indels的突变会导致密码子的变化,形成新的开放阅读框,并可能产生大量与自身高度不同的新抗原,多出现于高度微卫星不稳定的肿瘤[15]以及肾乳头、嫌色或透明细胞肿瘤中[16]。Turajlic等[16]通过肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库分析了涉及 19种肿瘤的 5 777个实体瘤样本的全外显子组测序( whole exome sequencing,WES)数据,结果显示,尽管 Indels的发生频率相较于 SNVs较低,但 Indels产生的新抗原比 SNVs的更具免疫原性,这可能是因为移码插入序列产生与已知序列无关的序列串,具有更强的异质性[15]。同样,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,发现 Indels衍生的预测新抗原的 MHC-Ⅰ结合亲和力比 SNVs高 3.9倍[17]。另外,基于 Indels的新抗原与黑色素瘤患者的抗程序性死亡受体 1(programmed cell death protein1, PD -1)或抗细胞毒性 T淋巴细胞相关蛋白 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA4)的 ICIs治疗反应显著相关[16]。

  融合基因可能来源于染色体内或染色体间的重排而导致的两个无关基因的结合[18]。早期融合基因主要在血液肿瘤和滑膜肉瘤中被发现,如典型的 BCR-ABL融合基因[19-20]。随着二代测序技术的发展,在各类肿瘤中发现了大量新的融合基因,包括前列腺肿瘤、头颈肿瘤等[21-22]。而研究结果表明,基因融合衍生的肿瘤新抗原具有良好的免疫原性[22 -23]。Wei等[24]从 6 552 个 TCGA 样本中预测了总共 67 502个融合新抗原。与 SNVs和 Indels 相比,融合基因可以产生高达 6 倍的候选新抗原和高达 11倍的特异性候选新抗原[24]。并且,研究者还发现,在 TCGA 中 5.8%的融合新抗原在患者之间共享[24]。但总体而言,融合基因是相对罕见的事件[25],融合基因衍生的新抗原用于治疗性疫苗仍需进一步的研究。

  剪接变异产生的大量转录物可以产生新的抗原,包括 mRNA 剪接点突变、内含子保留或肿瘤细胞中剪接体机制失调等[26-29]。因此剪接变异衍生的新抗原是治疗性新抗原疫苗扩展到其他具有显著可变剪接的低突变肿瘤的方式之一。Kahles等[30]分析了来自 TCGA 的 8 705 例患者和 670名匹配的正常对照的 WES和转录组测序(RNA Sequencing, RNA-seq)数据,证明了肿瘤特异性的外显子-外显子连接产生的多肽具有结合 MHC-Ⅰ的潜力并可能充当新抗原。而 Jayasinghe等[26]也同样发现剪接位点产生突变诱导的新抗原的数量可能比错义突变高几倍,并且在部分剪接变异肿瘤中观察到 PD-1和程序性死亡-配体 1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的高表达,表明肿瘤中具有剪接突变的患者可能从 ICIs治疗中获益。

  现在的新抗原预测一般需要经过样本获取、测序、人类白细胞抗原分型[( human leukocyte antigen,HLA)typing]、突变肽段的推测、预测 HLA结合和抗原递呈、选择候选新抗原、排序等过程。

  高质量的肿瘤标本的获取是执行新抗原预测和筛选的第一步。新鲜肿瘤组织的 DNA完整性好,既可以用于 DNA提取,也可以用于 RNA提取。但是目前大多数已完成或者正在进行的研究主要集中于晚期肿瘤患者,通常需要在经病理确诊之后进行额外的有创性操作以获取肿瘤组织。而局部活检穿刺获取的样本,因受限于实体肿瘤复杂的异质性,不能很好地代表肿瘤整体[31],例如病变中支持肿瘤的间质细胞和血管系统,以及小块坏死组织,在取样操作前很难评估,可能会限制获得用于测序的肿瘤 DNA和 RNA的质量和纯度。因此,对于晚期患者,有研究探索了通过循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)以及胸水样本进行新抗原筛选,分别从 ctDNA和胸腹水测序突变中筛选了 9条及 12条具有高亲和力的新抗原肽[32],但仅有 1条多肽能被自体 T细胞所识别。用于新抗原鉴定的另一种常见组织选择是甲醛固定的石蜡包埋(formalin-fixed, paraffinembedded,FFPE)样本[10, 32]。FFPE样本具有在临床环境中常规收集的明显优势,但手术保留的 FFPE标本可能间隔时间较久,而不能很好反映当前的肿瘤突变状况。FFPE标本与新鲜标本的匹配结果显示,FFPE样本的变异数量是配对的新鲜冷冻样本的 5倍[33]。目前提出的可能解决方法包括 FFPE样本特定的 DNA提取试剂盒以及选择一种以上的工具对细胞变异进行筛选,取其共同变异部分,已有研究表明可提高与新鲜样本的一致性[34]。但其局限性在于特异性尚可而敏感性不足,因为可能忽略了具有潜在临床意义的变异。

  从患者身上获取肿瘤活检标本和非恶性组织样本(通常是外周血单核细胞)提取 DNA后,需进行 WES,以比较肿瘤和胚系 DNA[35-36]。通常需要额外的 RNA测序以提供突变基因表达的信息用于进一步确认[27, 37-38]。许多现有的软件工具用于实现突变识别。常用工具包括 MuTect/MuTect2、 Strelka/Strelka2、VarScan2、SomaticSniper、 GATK等,它们在检测不同的突变类别(如 SNVs或 Indels)、处理肿瘤异质性的同时保持可接受的准确度的能力各不相同[39 -44]。如 MuTect2和 Strelka在检测等位基因比例较低的 SNVs时具有较高的敏感性,可以准确地检测亚克隆变异。VarScan2和 SomaticSniper通常在等位基因比例较高的情况下具有优势,并且在区分生殖系变异和肿瘤变异方面具有更好的性能。目前还没有统一的完美解决方案,通常的方法是针对不同的突变使用不同工具或者联合使用[45]。

  新抗原发现过程中最复杂的步骤是从通过测序手段鉴定的突变中进行抗原的计算和预测[46-47]。在患者中,已知存在 16 000多个不同等位基因的经典人类白细胞抗原Ⅰ类分子(HLA-A/B/C)和8 000个Ⅱ类(HLA-DP/-DQ/-DR)分子[48-49]。突变肽具有与患者的至少一个 MHC等位基因结合的能力,是形成 T 细胞识别的最基本要求。目前尚缺乏一致的方法来进行新抗原的预测。最近的研究通常使用受试者工作特征( receiver operating characteristic,ROC)曲线作为性能指标来评估人类 MHC-Ⅰ结合和呈递的预测工具或小鼠 T细胞反应的预测工具[50-51]。主要的预测算法包括基于人工神经网络方法的 NetMHC4[ 52 ]、基于泛特定方法的 NetMHCpan [ 53 ]、基于位置特异性评分矩阵的 PSSMHCpan[54]、免疫表位数据库(Immune Epitope DataBase,IEDB)[55]等。最近的研究发现亲和力以外的一些指标如 MHC-Ⅰ结合稳定性、基因表达丰度和多肽异质性可以用来改善Ⅰ类新抗原预测的性能[56]。其中新抗原肽-MHC复合体的稳定性被认为比结合亲和力更重要,因为更高的稳定性可能会增加该复合体被 T细胞识别的可能性[57]。

  到目前为止,表位预测方法主要集中在 MHC-Ⅰ结合表位上,而 MHC-Ⅱ结合表位预测的研究相对较少。抗原特异性 CD4+和 CD8+T细胞的协作对于有效的抗肿瘤免疫至关重要[58]。仅表达一种 MHC-Ⅰ新抗原是不够的,肿瘤小鼠模型中有意义的抗肿瘤免疫至少需要一种额外的 MHC-Ⅱ类新抗原[59]。事实上,已经在几个临床试验中观察到在接种疫苗后,优先诱导 CD4+T细胞反应而不是 CD8+T细胞反应[7-10, 60]。因此,个体化新抗原疫苗应包含预计与患者的 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ等位基因结合的新表位。MHC-Ⅰ型结合槽具有封闭的两端,结合 8~11个氨基酸长度的多肽,以便呈递给 CD8+T细胞。相比之下,MHC-Ⅱ肽结合槽有开放的两端,这使得它能够结合和呈现更长的肽。另外,MHC-Ⅱ分子核心结合部分两侧的肽区域可以影响肽的结合[61]。综上所述,MHC-Ⅱ多肽结合的这些特征使免疫原性 MHC-Ⅱ表位的鉴定变得复杂。Abelin等[62]开发了一种称为 MAPTAC(mono -allelic profiling technology)的分析技术,并在此基础上训练了结合预测算法 neonmhc2。另外,Racle等[63]从 23个不同的组织样本中筛选了将近 80 000个独特的肽进行分析,开发了一种表位预测算法 MixMHC2pred。另外,一种多模态递归神经网络 MARIA(具有递归集成架构的 MHC分析)被开发用于预测 HLA-Ⅱ复合物呈递肽的可能性,并且其 ROC达到了 0.89~0.92[64]。而以往根据 IEDB中的肽结合亲和力数据开发的 MHC-Ⅱ结合表位预测算法 NetMHCIIpan也在 2020年进行了更新,具有更好的预测水平[65]。

  合成肽疫苗是一种使用较多的个体化新抗原疫苗平台。在研究早期,基于多肽的癌症疫苗通常由 MHC-Ⅰ结合短肽组成。尽管这些疫苗产生了相应的 T 细胞反应,但其中大多数表达 MHC-Ⅰ分子的细胞不专门用于抗原呈递,从而导致 T细胞启动或耐受性不佳[66 -67]。相比之下,合成长肽疫苗(synthetic long-peptide,SLP)接种必须在疫苗引流淋巴结中通过专业抗原递呈细胞(如 DCs)进行摄取和加工才能完成递呈和 T细胞活化。经 DCs内化后,一部分 SLP通过胞内体途径降解并加载到 MHC-Ⅱ分子上,允许 CD4+T辅助细胞识别[68]。另一部分内吞 SLP进入胞质,并由 MHC-Ⅰ分子交叉呈递,激活 CD8+ CTL[69-70]。这种通过加工 SLP从而产生抗原特异性 CD8+ T 细胞反应的方式可以避免可能的 CTL耐受机制[71]。另外 SLP新抗原疫苗提供了潜在的 MHC-Ⅱ类表位,从而涉及 CD4+和 CD8+T细胞反应[72-73]。近年来,多项临床试验测试了 SLP新抗原疫苗的功效。Ott等[7]为ⅢB/C期或Ⅳ期(M1a/b)的高危黑色素瘤患者设计并制备了包含 20多种新抗原的个体化肽疫苗,并配合佐剂聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic-Polycytidylic acid, Poly-ICLC)一起皮下注射,结果表明 4例Ⅲ期黑色素瘤患者接受疫苗治疗后 32个月未见肿瘤复发, 2例Ⅳ期黑色素瘤患者虽然在接受疫苗后仍发生肿瘤进展,但是在接受 PD-1抑制剂后出现了完全的肿瘤消退。而更值得关注的是,55 个月的随访结果显示,所有 8例患者都还存活,6例患者没有表现出活动性疾病的迹象。而且在接种新抗原个体化肽疫苗后,新抗原特异性 T 细胞反应在黑色素瘤患者中持续存在数年,并且持续存在记忆表型的新抗原特异性 T 细胞[3]。

  DNA 疫苗可以通过将感兴趣的基因插入细菌质粒来产生 [74]。所有类型的表位都可以通过 DNA格式进行编码。DNA疫苗可以快速合成,在常规条件下保存,并可以通过皮下、肌内、皮内和黏膜注射方便地给药[75]。新抗原 DNA疫苗已在临床前及临床研究中被证明其能够诱导针对肿瘤的有效免疫反应并且具有良好的安全性。最近,一种使用电穿孔介导的多种新抗原 DNA疫苗被证明能在小鼠肿瘤模型中诱导与抗肿瘤免疫相关的CD8+ T细胞反应[76]。Yang等[77]建立了一个基于 DNA的多种新抗原疫苗平台,证明了新抗原 DNA疫苗能被 DCs有效摄取并诱导针对小鼠黑色素瘤的有效免疫反应,从而显著抑制黑色素瘤的生长。Aurisicchio等[78]通过结合电穿孔的新抗原 DNA疫苗诱导了特异的免疫反应,并抑制了人源肿瘤组织来源的移植瘤模型的肿瘤生长。2022年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)报告了一项基于新抗原 DNA疫苗联合白细胞介素 2(interleukin-2,IL-2)和 Pembrolizumab的 1/2期临床研究,研究结果显示诱导了新抗原特异性的 CD8+细胞,并报道 1例患者获得了部分缓解(partial response,PR)的疗效[79]。

  与 DNA新抗原疫苗比较,RNA新抗原疫苗的制造相对简单,并且具有内置的佐剂[80]。目前 RNA疫苗主要直接注射到淋巴结内,在Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤患者的Ⅰ期临床试验中,研究者为 13例可评估的黑色素瘤患者设计了包含 20个患者特异性突变的新抗原 RNA疫苗,研究结果表明新抗原 RNA疫苗诱导了针对多种疫苗新表位的 CD4+和 CD8+T细胞反应,观察到了客观反应,并且通过接种疫苗显著降低了累积复发率,从而诱导了持续的无进展生存获益[8]。而脂质体运载(lipoplexes, LPX)技术以及脂质纳米粒(lipid nanoparticle,LNP)递送技术的发展[81-82],为新抗原 RNA疫苗提供了更多的给药方式。最近在 4例胃肠癌患者中进行的Ⅰ期临床试验的数据表明,用 LNP进行新抗原 RNA疫苗肌肉接种是安全的,并且可以诱导突变特异性 T细胞反应[83]。

  与多肽疫苗相比,核酸疫苗有助于抗原的持续有效表达和免疫刺激。重要的是,基于核酸的疫苗可使细胞自身合成抗原肽,避免了昂贵且困难的蛋白质纯化,并为蛋白质配备了天然的翻译后修饰。核酸疫苗在功效、缩短设计和制造时间以及生产可扩展性和可靠性方面具有优势[84]。而比较 DNA和 RNA疫苗两者,DNA携带遗传信息,需要进入细胞核才能表达抗原,而 mRNA在不进入细胞核的情况下以更好和集中的方式指导抗原的产生。此外,鉴于其固有的免疫原性特征,mRNA可以用作佐剂,并且仅需要较低的剂量来引发最佳的免疫反应,使其成为新抗原疫苗的安全和有前途的平台[85]。但与多肽疫苗相比,核酸新抗原疫苗呈递到 DCs之前需要更多的加工步骤。

  多肽及核酸新抗原疫苗均需面对如何被人体的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells,APC)有效地摄取和呈递的问题。而新抗原 DCs疫苗可以通过与新抗原对应的肽进行共培养负载肽后,重新通过皮内、皮下或者静脉注射等方式回输至患者体内,从而避免体内抗原捕获、处理、呈递和 DCs成熟的过程[86-87]。基于 DCs的新抗原疫苗已在几项临床研究中进行了探索,包括高突变负荷的黑色素瘤[88-89]、NSCLC[90]、中低突变负荷的肝细胞癌[12]等。Carreno等[88]证明在Ⅲ期黑色素瘤患者中,新抗原 DCs疫苗诱导的新抗原特异性 T细胞的广度和多样性显著增加。本课题组前期报道的一项研究中纳入了 12例无标准治疗方案的晚期 NSCLC患者,后续均接种了新抗原 DCs疫苗,结果显示该疫苗具有良好的安全性,可以诱导特定的 T 细胞免疫,显示出 25%的客观应答率[90];并且 1例全身播散性转移的晚期患者在接受 5剂个体化 DCs疫苗治疗后,总体肿瘤病变减少了 29%[90]。该试验首次证明了基于新抗原的 DCs疫苗对肿瘤患者的疗效。

  笔者团队目前正在进行一项Ⅰ期临床试验,以探索在肝细胞癌中筛选新抗原肽的可行性,并在此基础上确定负载新抗原 DCs疫苗在具有高危复发风险的肝癌患者中的安全性及有效性(NCT04147078)。目前初步的研究结果证实,在肝细胞癌患者中进行新抗原 DCs疫苗辅助治疗是可行的,并且可以诱导新抗原特异性反应,而且具有良好的安全性。

  目前,多数临床试验通过体外分化培养的单核细胞来源的 DCs进行疫苗接种,主要是因为目前还不能获得足够数量的其他更相关的 DCs亚群用于疫苗接种。然而,单核细胞来源的 DCs并不具备其他 DCs亚群所具有的完整的共刺激分子和抗原交叉递呈机制[67]。传统的 1型 DCs(cDC1)亚集已被证明在交叉呈递和 CD8+T细胞激活方面更优越,而 cDC2亚集被认为可启动 CD4+T细胞[91]。此外 DCs培养方案的改进将为大量获取不同的 DCs亚型提供了可能 [92],这将有助于确定 DCs疫苗在诱导治疗性抗肿瘤反应方面的线 新型抗原递送平台

  核酸或者基于多肽的新抗原疫苗往往可能面临无法有效地前往或者靶向淋巴结 DCs的情况,而纳米颗粒(nanoparticles,NPs)长期以来一直是一种改善疫苗递送的有吸引力的策略[93]。通过纳米疫苗递送系统,纳米疫苗可以有效地输送到二级淋巴组织并保留在淋巴结中相对较长的时间。其次,纳米疫苗可以将多种协同佐剂和抗原共同递送到淋巴结和 APC[94-96]。并且通过共同封装佐剂和抗原,纳米疫苗可以改善其药物有效载荷的药代动力学特性,从而进一步增强由此产生的免疫调节作用[97]。Wang等[98]设计了一种基于肿瘤微酸性/近红外光敏感的新抗原刺激性 DCs纳米疫苗,通过响应肿瘤微酸性信号,可控释放卡托普利药物用以降低 N2型肿瘤相关中性粒细胞的免疫抑制作用;通过响应外源近红外光信号产生的活性氧自由基用以提高原位肿瘤免疫原性;在 H22荷瘤小鼠中实现 83%的肿瘤完全消退并延长了存活时间。最近,Baharom等[99]报告了一种由自组装纳米颗粒疫苗平台制备的新抗原多肽疫苗,与皮下免疫相比,静脉内疫苗接种诱导了更高比例的 T细胞特异性转录因子 1(T-cell specific tranion factor 1,TCF1)阳性的 CD8+PD-1+T细胞,并且在检查点阻断后,由静脉回输产生的干细胞样细胞增殖并分化为效应细胞,与治疗模型中的皮下回输相比,产生了更好的抗肿瘤反应。基于新抗原多肽疫苗可能更主要引起 CD4相关的免疫反应,Arbelaez等[100]设计了针对KRAS G12D突变相应新抗原多肽的阳离子脂质复合物(SLP-LPX),SLP-LPX免疫后可以刺激 CD4+和 CD8+T 细胞,并以 CD8+T 细胞依赖性方式抑制肿瘤生长;另外还发现,SLP-LPX 疫苗与 ICIs组合可以明显抑制肿瘤的生长。同时,另外基于纳米疫苗的两项研究中也发现了类似的同时激活 CD4+和 CD8+T 细胞的现象[101-102]。以上结果均证明了使用纳米递送系统在新抗原疫苗中具有良好的前景。

  尽管随着测序技术以及各种算法的进一步发展,新抗原疫苗的发展已经有了长足的进步,但目前仍有许多挑战需要解决。首先是需要再次强调的是恶性肿瘤异质性的本质,同一肿瘤病灶的多次活检可能会发现不同的分子特征[103-104],并且在患者的不同转移灶或原发肿瘤中的候选新抗原不同[105]。基于当前的临床实践,许多新抗原疫苗方案都基于单个活检样本,这些样本既不能完全捕获所探测的单个肿瘤病变的异质性,也不能在寡转移或多转移疾病的情况下具有代表性[106]。因此,由此产生的复合新抗原疫苗可能只代表患者病变中目标的一小部分。

  新抗原呈递的复杂机制决定了新抗原预测的困境。对于肿瘤新抗原预测算法,必须考虑各种参数,例如抗原肽长度、抗原加工相关转运体结合、 MHC亲和力、抗原肽结合的主要组织相容性复合物(peptide major histocompatibility complex,pMHC)的稳定性和肿瘤新抗原来源[107]。因此,基于机器学习和人工智能技术的预测算法仍必须通过验证数据集进行不断更新[108]。

  另外,T 细胞耗竭是抗肿瘤免疫疗法的主要挑战之一。同样,在新抗原疫苗的临床研究中发现了诱导 CD4+T细胞和 CD8+T 细胞表达的多种抑制性受体 [7-10],并导致细胞因子产生受损[肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)、干扰素 γ(interferon-gamma,IFN-γ)和 IL-2]和 T细胞增殖减少[109-112]。

  针对肿瘤新抗原的各种免疫治疗策略的最终目的是诱导和(或)放大肿瘤特异性 T细胞反应。由于疫苗生产周期和患者病情进展的限制,许多针对肿瘤新抗原的临床研究往往缺乏必要的时间来验证预测的候选肿瘤新抗原的免疫学性质。在目前的研究中,酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISpot assay)常常用于评估新抗原特异性 T 细胞反应[113-114],但其并不能用于确定抗原特异性 T 细胞反应的绝对数量。MHC多聚体技术也常用来检测新抗原特异性 T细胞。另外,肿瘤特异性 T细胞反应也可以通过表征免疫治疗前后患者 T细胞受体池的变化来进行分析。这些工具共同提供了高度特异性检测方式,但是真正实现临床应用仍然存在较多障碍[115]。

  如前所述,新抗原疫苗的制备通常需要经过标本获取、DNA/RNA的提取、测序及分析、新抗原的预测和合成等一系列步骤,往往需要较长的制备周期。如 Ott团队[7]关于未经治疗的高危黑色素瘤的临床研究中,患者需经过 3个月左右的时间才能接种新抗原疫苗;另外一Ⅰb期胶质母细胞瘤临床研究中,患者虽然在术后接受了放射治疗,但平均约需要 4个月时间才接种新抗原疫苗[10]。最近,Cai等[11]进行的临床研究中,从肝切除到第一次接种疫苗的中位持续时间为 86 d,范围为 59~159 d。对于肿瘤患者,缩短治疗等待时间对预防疾病的进展十分关键。另外,目前新抗原疫苗的设计大多来自于 SNVs,往往具有高度的个体特异性,而很少具有共享的新抗原。因此,每例患者均需要进行个体化的定制,从而导致高昂的治疗成本。FDA批准的首款 DCs的自体前列腺癌疫苗 Sipuleucel-T(Provenge) 3次治疗的费用高达 10万美元,远远超过一般家庭的承受能力[116]。

  通过多点取样并测序来预测肿瘤的新抗原需要额外的侵入性操作,可行性较差,很难在实际临床上应用和推广。计算算法的发展可以在一定程度上通过单点取样估算患者整体的异质性。近期,Fang等[117]通过获取 69 例 NSCLC 患者的肿瘤 WES数据,通过新的算法计算了单点取样与多点取样的肿瘤异质性,结果显示新算法预测的单点取样的异质性与整体具有高度相关性(r=0.96);并且,研究发现在 NSCLC患者中,肿瘤内异质低的患者克隆新抗原比例更高,且新抗原和 MHC 亲和力能力得分更高。

  随着液体活检技术的发展和成熟,患者血液中的 ctDNA可以更容易进行收集及分析,并且 ctDNA可以更全面地体现多部位疾病的特征,在既往研究中进行了尝试。但 ctDNA 样本中突变的等位基因频率通常很低,并且目前的技术仅限于检测一组预定的突变,从而限制了其在新抗原预测中的价值,而需要进一步的技术突破。

  癌症疫苗研究领域的一项主要挑战是我们如何提高 T细胞的反应,特别是最大限度地诱导 CD8+T 细胞的激活和扩增。为了实现这一目标,可能需要促进 APC功能和 T细胞最佳启动的联合疗法。有可能实现这一目标的治疗药物包括 ICIs、共刺激受体激动剂(如 CD40)、TOLL样受体(toll-like receptors,TLR)激动剂等。另外,抗原疫苗安全且耐受性良好,与其他药物结合使用增加毒性的风险较低。Knuschke及同事[118]的研究结果表明,在小鼠逆转录病毒模型中,治疗性疫苗联合 ICIs疗法可以诱导初始 T细胞活化,并增强耗竭 T 细胞的效应功能。近日,研究报道了在小鼠的 MC38肿瘤模型中,新抗原疫苗和 ICIs联合治疗有效地抑制了耗竭 CD8+ T 细胞和 Treg细胞的增殖能力,增加了 Th1-like CD4+T细胞和效应 T细胞的比例,并且诱导抗原特异性 CD8+T 细胞群具有活跃的趋化因子信号传导(Cxcr3+/Ccl5+)、较低的共抑制受体表达(Lag3-/Havcr2-)和更高的细胞毒性(Fasl+/Gzma+)。另外,在黑色素瘤的临床研究中,2例患有复发性肿瘤的患者在接受 Pembrolizumab 治疗后肿瘤完全消退[7],而在另外一项新抗原疫苗和 ICIs联合治疗黑色素瘤、NSCLC和膀胱癌的临床研中,联合治疗诱导了持久的新抗原特异性 T 细胞反应性,具有细胞毒性的新抗原特异性 T细胞能够迁移到肿瘤并且形成了表位扩散[89]。上述研究结果表明,新抗原疫苗接种和 ICIs 治疗相结合可以通过各种机制增强 T细胞反应并克服 T细胞耗竭。截止至 2022年 6月,以“neoantigen vaccine”为检索词在国际临床试验注册平台()中检索到涉及新抗原疫苗联合 ICIs治疗实体瘤的注册临床试验共 24项(表1),其中有 7项研究联合了双免疫疗法。在疫苗类型方面,包括 DNA疫苗 4项,RNA疫苗 6项,DCs疫苗 1项,其余均为多肽疫苗。

  作为多肽疫苗的重要组成部分,在肽疫苗中添加免疫佐剂对于诱导有效的免疫反应至关重要[119]。传统佐剂如弗氏不完全佐剂(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)和铝盐在短肽疫苗相关研究中被发现可能会诱导 T 细胞滞留、衰竭、缺失等缺陷[120]。共刺激分子 CD40 信号传导介导 DCs 的活化,导致 MHC 分子、共刺激标志物的上调和促炎细胞因子释放[121-122]。这提高了 DCs启动 CD4+和 CD8+T细胞的能力。此外,通过 CD40激活 DCs可刺激有效的交叉呈递,这对于诱导 CD8+T细胞对肿瘤抗原的反应至关重要 [123 -125]。在一项针对 GL261和 NSCL61神经胶质瘤模型的研究中,研究者通过将 FGK45(一种 CD40 的激动性抗体)添加到肿瘤裂解物疫苗中以探索 CD40 激动性抗体在疫苗中的作用。结果证明,添加 FGK45后可以在肿瘤模型中诱导更加明显的免疫反应且延长了两种肿瘤模型小鼠的存活。另一项涉及晚期前列腺癌的Ⅰ期试验中,研究者制备了靶向前列腺特异性膜抗原的自体抗原提呈细胞疫苗,在部分患者中检测到了 CD8+T 细胞反应,并伴有高水平的外周血 IFN-γ产生,但并没有生存相关的疗效获益[126]。另外,TLR3激动剂 Poly-ICLC在新抗原疫苗中得到了广泛地应用,在已报道的涉及黑色素瘤和胶质瘤的新抗原疫苗临床研究中,添加了 Poly-ICLC的新抗原疫苗可以有效地诱导特异性 T细胞反应[7, 9-10]。近期,有研究者开发了一种具有载体和免疫佐剂双重功能的低毒性胆固醇修饰的抗菌肽-DP7,它能够通过 TLR2-MyD88-NF-κB通路诱导 DCs成熟和促炎细胞因子释放,有效提高抗原呈递效率,为提高疫苗疗效提供了一种新的方案[127]。

  缩短疫苗的制备周期以及生产成本是新抗原疫苗进一步临床应用需实现的目标之一。因此,众多研究者将目标投向通用型新抗原疫苗。前期研究结果发现,神经胶质瘤中最常见的 IDH1突变影响密码 132并编码 IDH1(R132H),该 IDH1(R132H)具有一个共享的克隆新表位,并且主要与 MHC-Ⅱ类分子结合[128-129]。一系列临床前研究结果发现, IDH1(R132H)特异性肽疫苗在同源 MHC人源化小鼠中可以诱导特异性治疗性 T 辅助细胞反应,有效对抗 IDH1(R132H)+肿瘤[128, 130-132]。近期,德国海德堡大学附属医院的 Michael Platten研究组[133]研制出了一种针对 IDH1基因突变的肿瘤疫苗(IDH-vac),并开展了一项多中心、单臂、开放标签、Ⅰ期临床试验,共入组了 33例新诊断的 WHO 3或 4级 IDH1(R132H)+星形胶质细胞瘤患者。在接受疫苗治疗的 32例患者中,总体反应率为 84.4%(27例);在可评价免疫反应的 30例患者中,93.3%(28例)患者引起了免疫反应,3年无进展生存率和总生存率分别为 0.63 [95%CI(0.44,0.77)]和 0.84 [95%CI(0.67,0.93)];2例免疫未应答的患者 2年内出现病情进展,显示出 IDH新抗原疫苗具有良好的免疫反应及临床疗效。而突变占比更高的 TP53、KRAS、PIK3CA等也得到了研究者的关注,并且在临床前研究及临床试验中发现共享的突变基因来源的新抗原肽诱导了特异性的免疫反应[83, 134-137]。

  近年来,随着基因组学和蛋白质组学技术的进步以及生物信息学工具的发展,对肿瘤新抗原的筛选能力有所加强。另外,广泛的基因组数据和计算机算法加速了肿瘤表位的预测,从而实现了新抗原表位的大规模筛选。但目前来说,新抗原疫苗仍然面临着如何优化疫苗中包含的抗原类型和数量、如何识别和递呈抗原等问题。同样关键的因素是持续的免疫抑制对疫苗功效的影响,特别是 T细胞的启动和衰竭。随着研究者对人体免疫系统及各种免疫疗法的进一步探索,特别是免疫检查点以及肿瘤微环境研究的深化,将有助于新抗原疫苗疗法的进一步突破,有望为肿瘤患者带来一种真正安全且有效的治疗方式。

上一篇:苏州KSG俱乐部发布战队挂牌公告暴风锐首当其冲

下一篇:如果我单身 我需要人寿保险吗